Практическая часть

Процесс выделения ДНК можно разделить на несколько стадий:

• Необходимо разрушить мембраны клеток, чтобы ДНК вышла в раствор. Для этого используем лизирующий буфер, содержащий поверхностно-активные вещества (ПАВ) и специальный фермент – протеиназу К. ПАВ разрушают клеточные мембраны, протеиназа расщепляет связывающие ДНК белки, а буферный компонент поддерживает pH на оптимальном для ДНК уровне. Однако, вместе с ДНК в растворе оказываются и другие компоненты клеток – белки, «осколки» клеточных мембран, сахара.
• Необходимо очистить ДНК от примесей. С помощью центрифугирования мы фильтруем наш раствор через силикатную мембрану на специальных колонках. ДНК обратимо связывается с мембраной, в то время как остальные органические компоненты клетки проходят сквозь нее. На этом этапе мы используем химические свойства ДНК, ее способность плохо растворяться в спиртах и хорошо – в воде.
• Мембрану со связанной ДНК несколько раз промываем изопропиловым и/или этиловым спиртом, чтобы окончательно избавиться от примесей.
• Наносим на мембрану колонки буфер для элюции. Элюция – извлечение вещества из твердого носителя вымыванием.

Выделенная и очищенная ДНК может храниться в морозильной камере при температуре −20°С в течение нескольких лет.

4. Для улучшения качества отжига рекомендуется подбирать праймеры так, чтобы последние несколько нуклеотидов 3' - конца праймера содержали GC-основания
5. Отсутствие внутренней вторичной структуры (праймеры не должны быть само- и взаимнокомплиментарными)
6. Отсутствие комплементарности между 3'-концами (чтобы не образовывалось праймер-димеров)
7. Оптимальная концентрация праймеров подбирается эмпирически, но не должна быть больше 50 пикомолей на пробирку - иначе начнётся неспецифический отжиг праймеров